導(dǎo)讀

實(shí)驗(yàn)周期長(zhǎng)、操作較復(fù)雜一直是宏基因組二代測(cè)序（mNGS）在臨床應(yīng)用的主要限制因素。2022 年 3 月 15 日，檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)權(quán)威期刊《Clinical Chemistry》（2021 年影響因子 8.327）發(fā)表了北京協(xié)和醫(yī)院和杰毅生物聯(lián)合發(fā)表的重要研究論文。研究團(tuán)隊(duì)通過改良測(cè)序接頭和開發(fā)了一套快速實(shí)時(shí)生信分析系統(tǒng)，并借助于杰毅生物自主研發(fā)的自動(dòng)建庫(kù)儀器，實(shí)現(xiàn)了在 NextSeq 測(cè)序平臺(tái)上全流程最快 9.1 小時(shí)的多樣本 mNGS 檢測(cè)，進(jìn)一步發(fā)揮 mNGS 在鑒定疑難、危重、特殊感染方面的優(yōu)勢(shì)，為危急重癥患者的快速精準(zhǔn)診療贏得寶貴的時(shí)間。

研究背景

宏基因組二代測(cè)序 (mNGS ) 具有無(wú)偏倚地檢測(cè)樣本中病原體的巨大潛力，也是鑒定新發(fā)突發(fā)病原微生物的重要手段，但其報(bào)告時(shí)限（TAT）較長(zhǎng)（≥15h）。盡管 Oxford Nanopore Technologies（ONT）測(cè)序平臺(tái)提供了 TAT≤6 小時(shí)的測(cè)序和檢測(cè)分析方案，但相較于 Illumina 二代測(cè)序方法，依然存在測(cè)序深度和 Reads 產(chǎn)出較低，成本較高和測(cè)序錯(cuò)誤率較高等不足。在面對(duì)各種疑似感染病癥時(shí)，臨床醫(yī)生始終有快速、準(zhǔn)確鑒定病原體的迫切需求，因此，提升 mNGS 檢測(cè)時(shí)效性成為了臨床病原微生物檢驗(yàn)關(guān)注的重點(diǎn)。

研究結(jié)果

改進(jìn)測(cè)序接頭結(jié)構(gòu)，實(shí)現(xiàn) “快速、實(shí)時(shí)”mNGS 分析

圖 1 通過對(duì)測(cè)序接頭的改進(jìn)，實(shí)現(xiàn)不影響測(cè)序質(zhì)量前提下的快速、實(shí)時(shí)分析

受到現(xiàn)有測(cè)序接頭和測(cè)序原理的限制，NGS 只能先獲取全部樣本的測(cè)序數(shù)據(jù)，再根據(jù)標(biāo)簽序列進(jìn)行數(shù)據(jù)拆分，最后完成序列比對(duì)分析，該固有流程是導(dǎo)致二代測(cè)序?qū)嶒?yàn) TAT 較長(zhǎng)的主要因素之一。本研究創(chuàng)新性地改良了測(cè)序接頭的結(jié)構(gòu)，接頭中插入了一段樣本特異的內(nèi)部標(biāo)簽序列（Internal Index），實(shí)現(xiàn)了對(duì)內(nèi)部標(biāo)簽序列進(jìn)行優(yōu)先測(cè)序和測(cè)序數(shù)據(jù)的提前拆分分析。為了避免這種接頭設(shè)計(jì)導(dǎo)致的核苷酸多樣性缺失、測(cè)序質(zhì)量不佳、產(chǎn)出數(shù)據(jù)不足的問題，研究者們組合搭配了三種不同長(zhǎng)度（6、7 和 8bp）的內(nèi)部標(biāo)簽（圖 1）。這樣的設(shè)計(jì)能在保證測(cè)序質(zhì)量的前提下，提前拆分分析樣本測(cè)序數(shù)據(jù)，實(shí)現(xiàn)快速實(shí)時(shí)的 mNGS 分析。

自動(dòng)化+實(shí)時(shí)生信分析，最快 9.1 小時(shí)完成 mNGS 全流程

圖 2 改良的接頭設(shè)計(jì)，結(jié)合自動(dòng)化建庫(kù)設(shè)備和生信實(shí)時(shí)分析流程，最終實(shí)現(xiàn)快速 mNGS

完成測(cè)序接頭的改良后，研究者開發(fā)了一套快速 mNGS 檢測(cè)方案，包括自動(dòng)化文庫(kù)制備、Illumina NextSeq 測(cè)序平臺(tái)和實(shí)時(shí)分析系統(tǒng)（圖 2）。實(shí)時(shí)分析監(jiān)控程序全程監(jiān)測(cè)測(cè)序進(jìn)度，并根據(jù)測(cè)序循環(huán)數(shù)調(diào)度分析任務(wù)。后續(xù)的性能驗(yàn)證證實(shí)了改良的測(cè)序接頭實(shí)現(xiàn)了快速檢測(cè)，在 NextSeq 測(cè)序平臺(tái)的全流程 TAT 降低到了 9.1~10.1 小時(shí) (圖 3，測(cè)序耗時(shí)約 6.1 小時(shí)，濕實(shí)驗(yàn)耗時(shí) 3~4 小時(shí))。而使用常規(guī)接頭，僅測(cè)序單一步驟耗時(shí)就達(dá)到約 11.7 小時(shí)，全流程周轉(zhuǎn)時(shí)間至少在 15 小時(shí)以上。

圖 3 測(cè)序分析耗時(shí)對(duì)比（改良的接頭 vs 經(jīng)典 TruSeq 接頭）

準(zhǔn)確性評(píng)估

圖 4 利用真實(shí)臨床樣本完成新方法的性能評(píng)估

為了進(jìn)一步縮減測(cè)序時(shí)間、并評(píng)估整套實(shí)驗(yàn)流程的準(zhǔn)確性，研究者使用改良后的測(cè)序接頭對(duì) 153 個(gè)下呼吸道標(biāo)本進(jìn)行了快速實(shí)時(shí) mNGS 檢測(cè)分析。研究者們綜合了標(biāo)本的臨床培養(yǎng)、16S/ITS 測(cè)序、PCR-sanger 測(cè)序和病毒的 qPCR 驗(yàn)證結(jié)果，形成一套復(fù)合標(biāo)準(zhǔn)，用于評(píng)價(jià)快速 mNGS 報(bào)告和常規(guī) mNGS 報(bào)告的準(zhǔn)確性（圖 4）。

圖 5 快速 mNGS 和常規(guī) mNGS 結(jié)果的準(zhǔn)確性評(píng)估

如圖 5 所示，基于復(fù)合參考標(biāo)準(zhǔn)，快速 mNGS 的細(xì)菌檢測(cè)能力達(dá)到了陽(yáng)性符合率 85.1%，陰性符合率 100%；真菌檢測(cè)能力達(dá)到了陽(yáng)性符合率 80.3%，陰性符合率 97.4%；病毒檢測(cè)能力達(dá)到了陽(yáng)性符合率 96.8%，陰性符合率 98.0%。

總結(jié)

本研究基于杰毅生物 mNGS 自動(dòng)化解決方案，創(chuàng)新開發(fā)了改良的測(cè)序接頭和實(shí)時(shí)快速分析系統(tǒng)，以 9.1 小時(shí)首次刷新了 Illumina NextSeq 測(cè)序平臺(tái)下的 mNGS 檢測(cè)速度，性能驗(yàn)證結(jié)果證實(shí)這項(xiàng) “既快又準(zhǔn)” 的 mNGS 檢測(cè)技術(shù)有望為疑難、危重、特殊感染患者的救治提供更及時(shí)、更精準(zhǔn)、更全面的診療線索，開創(chuàng)臨床感染精準(zhǔn)診療的新局面。