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“大國器械”——醫(yī)療器械科技創(chuàng)新專訪
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華山醫(yī)院抗生素研究所王明貴教授專訪
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杰毅生物 2020 年度大事記
三度蟬聯(lián)，杰毅生物再登《杭州獨(dú)角獸與準(zhǔn)獨(dú)角獸企業(yè)》榜單
2024 年 4 月 24 日下午，由民建中央、中國科協(xié)指導(dǎo)，民建浙江省委會(huì)、中國投資發(fā)展促進(jìn)會(huì)聯(lián)合辦的第八屆萬物生長大會(huì)在杭州舉辦。會(huì)上，杭州市創(chuàng)業(yè)投資協(xié)會(huì)聯(lián)合微鏈共同發(fā)布了 《2024 杭州獨(dú)角獸&準(zhǔn)獨(dú)角獸企業(yè)》榜單。杰毅生物自 2022 年起連續(xù)三年榮登杭州準(zhǔn)獨(dú)角獸企業(yè)榜單，為杭州這座活力之城持續(xù)注入醫(yī)療健康的創(chuàng)新力量。
據(jù)悉，截至 2024 年 4 月，杭州共有 43 家獨(dú)角獸企業(yè)（估值不低于 10 億美元），準(zhǔn)獨(dú)角獸企業(yè) 382 家（估值不低于 1 億美元）。其中 “專精特新” 企業(yè)與準(zhǔn)獨(dú)角獸和獨(dú)角獸企業(yè)群體高度重合，具有高成長性和強(qiáng)創(chuàng)新能力。
杭州杰毅生物技術(shù)有限公司是一家專注于感染性疾病分子診斷的高新技術(shù)企業(yè)。公司聚焦感染疾病精準(zhǔn)診療領(lǐng)域，布局高通量測序（NGS）和基因編輯（CRISPR/Cas）兩大前沿技術(shù)平臺(tái)，擁有 100 多項(xiàng)發(fā)明專利等自主知識產(chǎn)權(quán)，搭建起了多層次，高品質(zhì)的產(chǎn)品線及服務(wù)體系。
杰毅生物將秉承 “讓每位感染患者第一時(shí)間得到精準(zhǔn)診療” 的愿景，堅(jiān)持價(jià)值創(chuàng)新鍛造企業(yè)競爭力，引領(lǐng)醫(yī)療健康行業(yè)高質(zhì)量發(fā)展。
病原宏基因組高通量測序臨床本地化檢測規(guī)范專家共識
中國藥師協(xié)會(huì), 中華醫(yī)學(xué)會(huì)細(xì)菌感染與耐藥防治分會(huì), 國家衛(wèi)生健康委臨床抗微生物藥物敏感性折點(diǎn)研究和標(biāo)準(zhǔn)制定專家委員會(huì).
DOI:10.3760/cma.j.cn112150-20230720-00019
基于 PCR-free 建庫的 mNGS 實(shí)驗(yàn)可在同一個(gè)空間內(nèi)設(shè)置試劑準(zhǔn)備區(qū)、標(biāo)本處理區(qū)（配備生物安全柜）和建庫測序區(qū)（PCR-free 建庫、文庫純化、等量混合、上機(jī)測序）。PCR-free 文庫濃度可能低于 Qubit 熒光定量儀的檢測限，建議使用熒光定量 PCR（quantitative polymerase chain reaction，qPCR）方法進(jìn)行文庫濃度測定。雖然基于 PCR-free 建庫的 mNGS 實(shí)驗(yàn)在文庫定量前實(shí)驗(yàn)操作不存在 PCR 擴(kuò)增建庫所帶來的氣溶膠風(fēng)險(xiǎn)，但仍然需要警惕人員操作等帶來的氣溶膠污染可能性，并在一個(gè)相對獨(dú)立的空間進(jìn)行 qPCR 法文庫濃度測定。
（1）濕實(shí)驗(yàn)應(yīng)由具備分子生物學(xué)檢驗(yàn)專業(yè)技能的人員，如分子生物學(xué)檢驗(yàn)專業(yè)檢驗(yàn)技師操作；
（2）干實(shí)驗(yàn)需要配備生物信息研發(fā)及管理人員，以保證分析流程、持續(xù)更新、性能確認(rèn)、維護(hù)及管理 ［12］；
（3）結(jié)果審核應(yīng)配備具有臨床感染病學(xué)相關(guān)知識的微生物檢驗(yàn)醫(yī)師。針對疑難報(bào)告，建議成立 mNGS 報(bào)告解讀團(tuán)隊(duì)，由具備臨床感染病學(xué)、臨床微生物檢驗(yàn)學(xué)、臨床分子生物學(xué)、生物信息學(xué)等相關(guān)專業(yè)知識的人員組成。所有人員均須通過崗位相關(guān)的培訓(xùn)和考核，并進(jìn)行定期能力評估方能上崗。
核酸提取和純化若使用手工操作，應(yīng)考慮不同標(biāo)本類型的差異、不同核酸提取試劑盒的提取效率、純度以及片段大小等因素；若使用自動(dòng)化核酸提取儀系統(tǒng)，需要綜合考慮檢測通量、自動(dòng)化程度、成本、核酸質(zhì)量等因素。
實(shí)驗(yàn)室應(yīng)確定原始測序數(shù)據(jù)及 FASTQ 文件在服務(wù)器上存儲(chǔ)的位置，并明確具備唯一標(biāo)識的統(tǒng)一命名，便于數(shù)據(jù)調(diào)用與快速分類查找。文件命名建議包含數(shù)據(jù)檢測/分析日期、檢測實(shí)驗(yàn)室名稱、標(biāo)本類型、測序批次、唯一的標(biāo)本編碼等。命名規(guī)則一旦確定不得隨意改動(dòng)。
實(shí)驗(yàn)室可通過 FASTQC［19］ 和 MultiQC［20］ 等軟件查看測序數(shù)據(jù)質(zhì)量、總數(shù)據(jù)量、堿基質(zhì)量值（Q20 和 Q30）等，結(jié)合測序芯片泳道上生成的簇密度設(shè)置質(zhì)控點(diǎn)（如簇密度是否偏離有效范圍，堿基識別質(zhì)量值≥Q30 的數(shù)據(jù)比例是否偏低）判斷本批次數(shù)據(jù)能否用于后續(xù)分析。數(shù)據(jù)過濾規(guī)則可根據(jù)實(shí)驗(yàn)室對 mNGS 檢測的敏感性和特異性需求進(jìn)行調(diào)整，建議設(shè)置 Q30 堿基數(shù)量占比>75%、有效序列長度不小于 50bp、含 N 堿基比例小于 10% 等參數(shù)閾值。
為了提高微生物數(shù)據(jù)的分析時(shí)效性，需要去除測序數(shù)據(jù)中的宿主序列，通常方法是把比對到人類基因組的序列進(jìn)行過濾。真菌和寄生蟲與人類的基因組序列有一定的同源性，在過濾宿主序列的過程中需要評估運(yùn)行時(shí)間、去除效率與非特異性去除（非人源序列而被錯(cuò)誤過濾）的序列比例。
物種注釋是病原宏基因組檢測最核心的內(nèi)容之一，主要是將通過質(zhì)量控制的非宿主序列與微生物參考數(shù)據(jù)庫比對，或者經(jīng)過從頭組裝成 contigs/scaffolds 后再比對到微生物參考數(shù)據(jù)庫，確定在特定序列相似性閾值（如≥97%）下的物種分類級別。物種注釋的準(zhǔn)確性取決于所選注釋工具的敏感性和特異性、算法閾值的合理性、參考數(shù)據(jù)庫的完整性及其納入微生物基因組的準(zhǔn)確性 ［12］。目前可用的注釋工具分為三類：
（1）DNA-to-DNA 比對工具；
（2）DNA-to-Protein 比對工具；
（3）基于特征標(biāo)記基因的比對工具。有研究表明，利用相同的模擬數(shù)據(jù)集測試不同的宏基因組學(xué)分類工具，發(fā)現(xiàn)不同的分類工具識別的物種數(shù)量可能相差 3 個(gè)數(shù)量級以上 ［21］。在 mNGS 中，DNA-to-DNA 工具往往比 DNA-to-Protein 工具能夠更好地進(jìn)行物種分類 ［22］，但 DNA-to-Protein 工具在識別新發(fā)和高度可變的基因序列時(shí)敏感性更高 ［23］。而在以注重物種豐度的微生物組學(xué)分析中，則推薦使用基于特征標(biāo)記基因的比對工具 ［24］。
總之，實(shí)驗(yàn)室在選擇物種注釋工具時(shí)，應(yīng)基于檢測的預(yù)期用途，從運(yùn)行速度、準(zhǔn)確率、精確率、召回率等維度評估性能 ［17］。實(shí)驗(yàn)室可使用近緣物種的基因序列對分析軟件的物種注釋功能進(jìn)行評估，另外在數(shù)據(jù)庫或分析算法有變更時(shí)，以及定期對本實(shí)驗(yàn)室的 mNGS 物種/基因注釋功能進(jìn)行評估。
微生物參考數(shù)據(jù)庫的選擇顯著影響物種注釋分類的結(jié)果 ［25,26］?！逗昊蚪M測序病原微生物檢測生物信息學(xué)分析規(guī)范化管理專家共識》［17］ 中對 mNGS 常用微生物數(shù)據(jù)庫的特征有較為詳細(xì)的描述。目前沒有任何一個(gè)公共數(shù)據(jù)庫能夠包含所有的潛在人類病原體的基因組信息（假陰性風(fēng)險(xiǎn)），且數(shù)據(jù)庫中不可避免地存在一些注釋錯(cuò)誤或污染的序列（假陽性風(fēng)險(xiǎn)）［27］。因此在構(gòu)建、使用和管理這類數(shù)據(jù)庫時(shí)需要重點(diǎn)關(guān)注以下問題：
（1）充分評估數(shù)據(jù)庫的全面性以及納入物種在分類學(xué)上的代表性。同一微生物，往往具有遺傳差異的不同亞型或株，在選擇基因組時(shí)，應(yīng)該考慮到微生物的遺傳多樣性，盡可能多地納入不同亞型或株的高質(zhì)量基因組；
（2）無論所選參考基因組的來源如何，實(shí)驗(yàn)室都需要通過重測序或其他技術(shù)手段確認(rèn)其注釋的準(zhǔn)確性，序列的完整性，避免納入錯(cuò)誤注釋、命名錯(cuò)誤或代表性不足的微生物序列；
（3）病原體（尤其是 RNA 病毒）在自然狀態(tài)下是不斷發(fā)生變異的，所以需要及時(shí)（或定期）對參考數(shù)據(jù)庫中的基因組信息進(jìn)行更新及驗(yàn)證 ［28,29］，更新的頻率取決于實(shí)驗(yàn)室或臨床的需求，以及序列在公共數(shù)據(jù)庫中的上傳或更新時(shí)間 ［28］；發(fā)生可能影響結(jié)果的數(shù)據(jù)庫修改、替換及更新等活動(dòng)均需要重新進(jìn)行評估；建議實(shí)驗(yàn)室每年對微生物數(shù)據(jù)庫進(jìn)行審核，必要時(shí)隨時(shí)進(jìn)行更新。但是對于使用本地化服務(wù)器的實(shí)驗(yàn)室，構(gòu)建的數(shù)據(jù)庫大小需要權(quán)衡服務(wù)器的計(jì)算能力以及報(bào)告的時(shí)效性要求。
mNGS 檢測到的微生物常以讀長數(shù)作為結(jié)果，但它受測序量、標(biāo)本質(zhì)量等因素的影響，并且同張芯片不同文庫分配的下機(jī)數(shù)據(jù)量會(huì)有波動(dòng)，所以有必要對讀長進(jìn)行歸一化處理 ［30］。建議將每百萬測序讀長中匹配到某一微生物基因組的特異讀長（reads per million，RPM）作為歸一化指標(biāo) ［30］。如果希望比較不同微生物在同一文庫中的讀長，則還需考慮微生物基因組大小不同帶來的差異（理論上，在相同條件下，基因組越長，測得的讀長越多），建議通過計(jì)算每百萬測序量下每一千個(gè)堿基的基因組長度的歸一化讀長來消除這種影響 ［28］。需要注意，由于 mNGS 檢測原理不同于 qPCR，RPM 不能作為微生物核酸的定量指標(biāo)。
由于缺乏標(biāo)準(zhǔn)的 mNGS 生物信息學(xué)分析方案，各實(shí)驗(yàn)室自建分析流程內(nèi)部使用的分析軟件與數(shù)據(jù)庫處在不斷更新、確認(rèn)及完善的動(dòng)態(tài)過程中。為了保證每批次臨床標(biāo)本結(jié)果的可溯源性及可重復(fù)性，實(shí)驗(yàn)室需要明確每一次測試所使用的軟件及數(shù)據(jù)庫的版本，建議在報(bào)告單中體現(xiàn)，至少應(yīng)包括分析日期、軟件名稱和版本號、對每個(gè)組成工具及算法的用戶自定義參數(shù)和系統(tǒng)默認(rèn)值等 ［28］，可使用版本管理工具如 Conda 完成 ［31］。此外，可使用流程管理工具如 Snakemake 和 Nextflow 等對整個(gè)工具集進(jìn)行版本控制。
（1）臨床標(biāo)本測序數(shù)據(jù)集：注釋充分、特征明確的臨床標(biāo)本測序數(shù)據(jù)（FASTQ 或其他格式）［32］；
（2）計(jì)算機(jī)模擬測序數(shù)據(jù)：利用序列模擬軟件模擬生成測序數(shù)據(jù)集 ［16,33］，要求既要具有與真實(shí)測序數(shù)據(jù)質(zhì)量相同/相似的技術(shù)參數(shù)（文庫片段長度分布、測序模式、測序錯(cuò)誤類型及頻率、測序質(zhì)量值、測序深度等）［16,34］，也要盡可能對臨床標(biāo)本的背景成分信息如宿主核酸、微生物和試劑背景核酸等進(jìn)行模擬；
（3）組合數(shù)據(jù)集：利用序列模擬軟件定量模擬一種或多種目標(biāo)病原體的測序數(shù)據(jù)，然后將模擬序列添加到目標(biāo)病原體陰性標(biāo)本的真實(shí)測序數(shù)據(jù)中，形成接近臨床標(biāo)本的模擬數(shù)據(jù)集 ［16］。
利用上述數(shù)據(jù)開展性能確認(rèn)，確定干實(shí)驗(yàn)流程的主要性能指標(biāo)，包括準(zhǔn)確率、精確率、召回率和 F1-Score（即精確度和召回率的調(diào)和平均值）等 ［28,35］。如果在比對過程中出現(xiàn)寄生蟲的假陽性結(jié)果（寄生蟲為真核生物，與宿主序列相似度較高，且部分寄生蟲基因組數(shù)據(jù)中存在人源序列的污染），需要考慮設(shè)置更高的陽性匯報(bào)閾值或者對相應(yīng)寄生蟲的基因組數(shù)據(jù)進(jìn)行清洗。常見的寄生蟲匯報(bào)閾值為與陰性對照相比 RPM 達(dá)到 10 倍以上，基因組數(shù)據(jù)清洗常采用把目標(biāo)寄生蟲基因組單獨(dú)與人基因組比對并去除高度同源的序列 ［36］。
表 1 模擬參考品示例
注：人源細(xì)胞濃度 1×10 5 cells/ml
- 批內(nèi)精密度：將上述參考品在同一時(shí)間內(nèi)用相同批次試劑完成 3 個(gè)全流程重復(fù)，分析批次內(nèi)結(jié)果重復(fù)性。
- 批間精密度：用不同批次的試劑分別將上述參考品在 3 個(gè)工作日內(nèi)完成各 3 個(gè)全流程重復(fù)，分析批次間重復(fù)性。
- 可接受標(biāo)準(zhǔn)：對陽性標(biāo)本，分析結(jié)果是指通過生信流程得到的檢出病原中包括該參考品中的病原體，則記為正確結(jié)果，否則為錯(cuò)誤結(jié)果。結(jié)果一致的實(shí)驗(yàn)數(shù)占全部實(shí)驗(yàn)數(shù)比例高于 95%，判斷為可接受。
- 樣本選擇：全流程檢測不少于 20 例標(biāo)本，包括 6 例陽性參考品（每例模擬混合參考品包含不少于 4 種微生物），14 例臨床標(biāo)本（不少于 10 例培養(yǎng)陽性）。分析檢測結(jié)果與已知參考品的內(nèi)含微生物以及臨床綜合判斷結(jié)果是否一致，對于結(jié)果不一致的使用 qPCR 或者送至另一穩(wěn)定運(yùn)行的 mNGS 實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行差異檢驗(yàn)。
- 可接受標(biāo)準(zhǔn)：20 例標(biāo)本中物種準(zhǔn)確性≥90%，則驗(yàn)證通過。對于臨床標(biāo)本，金標(biāo)準(zhǔn)方法和結(jié)合臨床信息綜合判定的病原體在 mNGS 檢測結(jié)果列表之中可判定為符合。
- 濃度選擇：使用陽性參考品梯度稀釋至擬定的檢出限濃度，可重復(fù)測定 5 次或在不同批內(nèi)對該濃度標(biāo)本進(jìn)行 20 次重復(fù)測定（如測定 5d，每天測定 4 份標(biāo)本）?？筛鶕?jù)情況選用稀釋液或陰性標(biāo)本，該稀釋液不得含有被驗(yàn)證的目標(biāo)病原體。
- 判斷標(biāo)準(zhǔn)：如果是 5 次重復(fù)檢測，必須全部檢出靶核酸；如果是 20 次檢測，必須檢出至少 19 次（95% 檢出率）靶核酸。
- 實(shí)驗(yàn)過程：將投入 5~10 倍 LoD 病原體的臨床模擬標(biāo)本，在 4℃、-20℃冰箱分別保存 1、4、7d，在-80℃冰箱分別凍融 1 和 2 次，評估對檢測結(jié)果的影響。
- 可接受標(biāo)準(zhǔn)：所有重復(fù)均檢出目標(biāo)病原體。
臨床檢測性能評價(jià)主要采用觀察性研究。觀察性研究中通過評價(jià) mNGS 檢測結(jié)果與臨床其他參考方法結(jié)果的一致性，確認(rèn)敏感性和特異性。研究應(yīng)遵循《世界醫(yī)學(xué)大會(huì)赫爾辛基宣言》的倫理準(zhǔn)則和國家涉及人的生物醫(yī)學(xué)研究倫理的相關(guān)要求，應(yīng)當(dāng)經(jīng)倫理委員會(huì)審查并同意。標(biāo)本量與預(yù)期用途、評價(jià)指標(biāo)等多種因素相關(guān)。標(biāo)本量估算通常是基于統(tǒng)計(jì)學(xué)要求的最低標(biāo)本量估計(jì) ［41］。值得注意的是，在評價(jià)某些罕見的病原體，陽性病例的數(shù)量有限，可以引用文獻(xiàn)報(bào)道的臨床敏感性和特異性作為理論支撐 ［42］。實(shí)驗(yàn)室可采用 “代表性病原體” 進(jìn)行臨床診斷性能評價(jià) ［43,44,45］，比如根據(jù)臨床預(yù)期用途選擇不同類型的常見的病原體 ［43］，以期為同類病原體提供參考和借鑒。近年來已發(fā)表數(shù)篇基于腦脊液、呼吸道標(biāo)本、血漿等標(biāo)本類型的 mNGS 檢測流程和臨床性能確認(rèn)的研究可供實(shí)驗(yàn)方案參考 ［16,25,36,46,47］。
- 盡早使用：危急重癥感染或局部感染不及時(shí)處理則后果嚴(yán)重，恐危及生命時(shí)，應(yīng)在常規(guī)病原檢測基礎(chǔ)上，盡早使用 mNGS 檢測輔助明確病原體 ［43,59］；特殊病原體感染，存在群體性感染事件風(fēng)險(xiǎn)，應(yīng)在開展常規(guī)快速檢測的同時(shí)，盡早使用 mNGS 檢測輔助明確病原體。
- 在治療過程中使用：高度疑似感染性疾病，但傳統(tǒng)微生物檢測反復(fù)陰性且治療效果不佳時(shí)，考慮在完善常規(guī)病原學(xué)檢測的同時(shí)或在其基礎(chǔ)上開展 mNGS 檢測；傳統(tǒng)病原學(xué)檢測的結(jié)果不能解釋臨床表現(xiàn)的全貌或/和抗感染治療的反應(yīng)，懷疑同時(shí)存在其他病原感染時(shí)，考慮在進(jìn)一步完善更多病原學(xué)檢測的同時(shí)或在其基礎(chǔ)上開展 mNGS 檢測；特殊患者如免疫抑制、器官移植術(shù)后、反復(fù)住院、合并基礎(chǔ)疾病，疑似繼發(fā)感染、新發(fā)感染時(shí)，考慮常規(guī)病原學(xué)檢測的同時(shí)或在其基礎(chǔ)上開展 mNGS 檢測 ［60,61］。
- 擇期使用：表現(xiàn)為慢性或局部感染，或慢性疾病不除外感染，在嘗試常規(guī)病原學(xué)檢查未能明確致病源或/和規(guī)范性經(jīng)驗(yàn)抗感染治療無效時(shí)，建議在進(jìn)一步完善常規(guī)病原學(xué)檢測的基礎(chǔ)上，與患者充分溝通后擇期使用 mNGS 檢測輔助明確病原體 ［51］。
mNGS 檢測技術(shù)幾乎適用于所有類型的臨床標(biāo)本，標(biāo)本的選擇須結(jié)合患者情況、流行病學(xué)、病原體特性、受累器官及感染部位等狀況綜合考慮。懷疑高致病性、新發(fā)或突發(fā)傳染病原微生物時(shí)，標(biāo)本運(yùn)送須經(jīng)相關(guān)部門批準(zhǔn)，嚴(yán)格按照《人間傳染的病原微生物目錄》［63］ 的危害程度分類及國際民用航空組織《危險(xiǎn)品航空安全運(yùn)輸技術(shù)細(xì)則》［64］ 的分類包裝及轉(zhuǎn)運(yùn)要求運(yùn)輸標(biāo)本，如通過其他交通工具運(yùn)輸也應(yīng)參照以上述標(biāo)準(zhǔn) ［65］。臨床常見標(biāo)本的選擇見表 2。
表 2 mNGS 檢測的臨床標(biāo)本類型
從無菌部位采集標(biāo)本，應(yīng)嚴(yán)格執(zhí)行無菌操作，避免污染。從有菌部位采集標(biāo)本，應(yīng)采取相應(yīng)防污染措施，避免定植或污染菌對結(jié)果的干擾。標(biāo)本采集后應(yīng)使用無菌、無核酸污染、帶蓋的專用容器，采集后封口膜密封，識別碼標(biāo)記，及時(shí)（建議 2h 內(nèi)）送檢。臨床在送檢時(shí)盡可能提供詳細(xì)的臨床信息（如患者流行病學(xué)史、感染癥狀體征、疑似感染灶、疑似病原體、影像學(xué)/病理學(xué)證據(jù)等）供實(shí)驗(yàn)室人員綜合參考以便于測序數(shù)據(jù)的正確解讀。標(biāo)本運(yùn)輸過程中須防污染、防震蕩，使用冷鏈系統(tǒng)轉(zhuǎn)運(yùn)。
法定傳染病病原體：包括《傳染病防治法》規(guī)定的各類傳染病病原體。病原體種類應(yīng)根據(jù)國家相關(guān)法律法規(guī)的修正進(jìn)行及時(shí)調(diào)整。其他烈性傳染病病原體：建議參考《人間傳染的病原微生物目錄》中對高致病性病原體的相關(guān)定義。
建議根據(jù)國家規(guī)定和驗(yàn)證需求將標(biāo)本在有資質(zhì)的實(shí)驗(yàn)室內(nèi)進(jìn)行分離培養(yǎng)、特異基因片段檢測、特異性抗原抗體檢測等方法復(fù)核。如沒有剩余標(biāo)本，應(yīng)在做好生物安全防護(hù)的情況下進(jìn)行臨床重新采樣，應(yīng)用傳染病診斷標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定的實(shí)驗(yàn)室診斷技術(shù)進(jìn)行病原檢測，基于病原檢測結(jié)果，結(jié)合臨床癥狀、流行病學(xué)史，依據(jù)現(xiàn)行傳染病診斷標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行診斷。
如患者被診斷為傳染病的，按照《傳染病防治法》等法律法規(guī)規(guī)定的流程上報(bào)疾控部門，并且對患者、標(biāo)本等進(jìn)行規(guī)范的處置。應(yīng)按要求將剩余標(biāo)本或重新采集標(biāo)本送上級部門進(jìn)行確認(rèn)，并上報(bào)患者情況，同時(shí)做好必要的患者隔離措施和相關(guān)治療工作。
若檢出疑似新發(fā)病原體，應(yīng)立即組織專家開展研判，尤其當(dāng)疑似新病原體的序列與已知的烈性或者高傳染性病原體序列相似，或者短時(shí)間內(nèi)從≥2 例流行病學(xué)相關(guān)患者中檢出疑似新病原體時(shí)，應(yīng)立即上報(bào)有關(guān)部門。
檢出法定傳染病及烈性傳染病病原，尤其是當(dāng)檢出甲類傳染病（鼠疫、霍亂）以及部分傳染性較強(qiáng)、危害較大的乙類傳染病（如傳染性非典型肺炎、脊髓灰質(zhì)炎、人類高致病性禽流感、炭疽等）病原體，應(yīng)立即對下機(jī)數(shù)據(jù)的質(zhì)量，特別是比對到烈性傳染病的特異性序列的準(zhǔn)確性、讀長數(shù)、基因組覆蓋度等數(shù)據(jù)進(jìn)行嚴(yán)格核實(shí)，確認(rèn)可排除背景核酸污染以及特異性序列比對無誤的前提下，同時(shí)啟動(dòng)標(biāo)本復(fù)核程序。當(dāng)從標(biāo)本中檢出明確可導(dǎo)致感染且能排除污染、定植微生物和背景核酸時(shí)，應(yīng)報(bào)告高度懷疑該病原菌為引起感染的病原菌?；颊邿o菌部位標(biāo)本如血液和腦脊液標(biāo)本中檢出可疑病原菌，在無其他感染病原證據(jù)且能排除污染、定植微生物和背景核酸時(shí)，應(yīng)報(bào)告為可疑致病微生物。從開放性腔道如呼吸道或可能存在皮膚定植菌污染部位的標(biāo)本中檢出條件致病微生物時(shí)應(yīng)結(jié)合序列數(shù)、文庫濃度、患者臨床病史信息、感染相關(guān)指標(biāo)，會(huì)同多學(xué)科專家進(jìn)行討論明確是否為責(zé)任病原體。報(bào)告單中應(yīng)至少包含檢出的病原微生物種屬名稱、唯一比對的讀長數(shù)、相對豐度和室內(nèi)質(zhì)控?cái)?shù)據(jù)，以及對術(shù)語、技術(shù)參數(shù)和病原微生物的注釋。mNGS 報(bào)告中的病原體物種名稱應(yīng)標(biāo)注標(biāo)準(zhǔn)的中英文名稱，部分可參考的網(wǎng)站包括細(xì)菌網(wǎng)站 https：//lpsn.dsmz.de/和真菌網(wǎng)站 https：//www.mycobank.org 等。
通過耐藥/毒力基因預(yù)測病原菌對抗菌藥物的敏感性以及病原體的致病力，可為臨床的抗感染治療提供參考依據(jù)。但需要注意的是，不是所有的耐藥/毒力基因存在即表達(dá)，可能存在基因型和表型不一致的情況；部分導(dǎo)致耐藥/致病的機(jī)制尚無法通過檢測基因來明確；目前對于耐藥/毒力基因的物種歸屬分析技術(shù)尚未完善。因此，應(yīng)謹(jǐn)慎開展以耐藥/毒力基因來預(yù)測病原微生物耐藥性和致病力。對于實(shí)驗(yàn)室可開展常規(guī)藥敏試驗(yàn)檢測病原菌對抗菌藥物敏感性結(jié)果的藥物，不宜以耐藥基因結(jié)果進(jìn)行預(yù)測，應(yīng)以表型法藥敏試驗(yàn)結(jié)果為準(zhǔn)。
執(zhí)筆人：
楊啟文（中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)院檢驗(yàn)科）；馬筱玲（中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)附屬第一醫(yī)院檢驗(yàn)科）；張建中（中國疾病預(yù)防控制中心傳染病預(yù)防控制所）；李軼（河南省人民醫(yī)院檢驗(yàn)科）；吳文娟（上海市東方醫(yī)院檢驗(yàn)科）；楊繼勇（解放軍總醫(yī)院檢驗(yàn)科）；韓東升（浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院檢驗(yàn)科）；李家斌（安徽醫(yī)科大第一附屬醫(yī)院感染科）；羅燕萍（解放軍總醫(yī)院檢驗(yàn)科）；周華（浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院呼吸科）；谷麗（首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京朝陽醫(yī)院感染科）；張西京（空軍軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科）；李敏（上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院檢驗(yàn)科）；單斌（昆明醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院檢驗(yàn)科）；胡付品（復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院抗生素研究所）；劉正?。ㄖ袊t(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)院感染科）；周海?。ㄖ袊膊☆A(yù)防控制中心傳染病預(yù)防控制所）
主要審稿專家（按姓氏首字母順序排列）：
陳德昌（上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科）；馮四洲（中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院血液病醫(yī)院血液科）；顧兵（廣東省人民醫(yī)院檢驗(yàn)科）；胡繼紅（國家衛(wèi)生健康委員會(huì)臨床檢驗(yàn)中心）；劉曉琳（國家衛(wèi)生健康委員會(huì)合理用藥專家委員會(huì)）；孫自鏞（華中科技大學(xué)附屬同濟(jì)醫(yī)院檢驗(yàn)科）；施毅（南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬金陵醫(yī)院呼吸科）；王明貴（復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院抗生素研究所）；王佳偉（首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京同仁醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科）；徐英春（中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)院檢驗(yàn)科）；肖永紅（浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院感染科）；俞云松（浙江省人民醫(yī)院感染科）；張耀華（中國藥師協(xié)會(huì)）；鄭磊（南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院檢驗(yàn)科）；鄭波（北京大學(xué)第一醫(yī)院感染科）；卓超（廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院感染科）；周鐵麗（溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院檢驗(yàn)科）
參考文獻(xiàn)：略
三度蟬聯(lián)，杰毅生物再登《杭州獨(dú)角獸與準(zhǔn)獨(dú)角獸企業(yè)》榜單
2024 年 4 月 24 日下午，由民建中央、中國科協(xié)指導(dǎo)，民建浙江省委會(huì)、中國投資發(fā)展促進(jìn)會(huì)聯(lián)合辦的第八屆萬物生長大會(huì)在杭州舉辦。會(huì)上，杭州市創(chuàng)業(yè)投資協(xié)會(huì)聯(lián)合微鏈共同發(fā)布了 《2024 杭州獨(dú)角獸&準(zhǔn)獨(dú)角獸企業(yè)》榜單。杰毅生物自 2022 年起連續(xù)三年榮登杭州準(zhǔn)獨(dú)角獸企業(yè)榜單，為杭州這座活力之城持續(xù)注入醫(yī)療健康的創(chuàng)新力量。
據(jù)悉，截至 2024 年 4 月，杭州共有 43 家獨(dú)角獸企業(yè)（估值不低于 10 億美元），準(zhǔn)獨(dú)角獸企業(yè) 382 家（估值不低于 1 億美元）。其中 “專精特新” 企業(yè)與準(zhǔn)獨(dú)角獸和獨(dú)角獸企業(yè)群體高度重合，具有高成長性和強(qiáng)創(chuàng)新能力。
杭州杰毅生物技術(shù)有限公司是一家專注于感染性疾病分子診斷的高新技術(shù)企業(yè)。公司聚焦感染疾病精準(zhǔn)診療領(lǐng)域，布局高通量測序（NGS）和基因編輯（CRISPR/Cas）兩大前沿技術(shù)平臺(tái)，擁有 100 多項(xiàng)發(fā)明專利等自主知識產(chǎn)權(quán)，搭建起了多層次，高品質(zhì)的產(chǎn)品線及服務(wù)體系。
杰毅生物將秉承 “讓每位感染患者第一時(shí)間得到精準(zhǔn)診療” 的愿景，堅(jiān)持價(jià)值創(chuàng)新鍛造企業(yè)競爭力，引領(lǐng)醫(yī)療健康行業(yè)高質(zhì)量發(fā)展。
病原宏基因組高通量測序臨床本地化檢測規(guī)范專家共識
中國藥師協(xié)會(huì), 中華醫(yī)學(xué)會(huì)細(xì)菌感染與耐藥防治分會(huì), 國家衛(wèi)生健康委臨床抗微生物藥物敏感性折點(diǎn)研究和標(biāo)準(zhǔn)制定專家委員會(huì).
DOI:10.3760/cma.j.cn112150-20230720-00019
基于 PCR-free 建庫的 mNGS 實(shí)驗(yàn)可在同一個(gè)空間內(nèi)設(shè)置試劑準(zhǔn)備區(qū)、標(biāo)本處理區(qū)（配備生物安全柜）和建庫測序區(qū)（PCR-free 建庫、文庫純化、等量混合、上機(jī)測序）。PCR-free 文庫濃度可能低于 Qubit 熒光定量儀的檢測限，建議使用熒光定量 PCR（quantitative polymerase chain reaction，qPCR）方法進(jìn)行文庫濃度測定。雖然基于 PCR-free 建庫的 mNGS 實(shí)驗(yàn)在文庫定量前實(shí)驗(yàn)操作不存在 PCR 擴(kuò)增建庫所帶來的氣溶膠風(fēng)險(xiǎn)，但仍然需要警惕人員操作等帶來的氣溶膠污染可能性，并在一個(gè)相對獨(dú)立的空間進(jìn)行 qPCR 法文庫濃度測定。
（1）濕實(shí)驗(yàn)應(yīng)由具備分子生物學(xué)檢驗(yàn)專業(yè)技能的人員，如分子生物學(xué)檢驗(yàn)專業(yè)檢驗(yàn)技師操作；
（2）干實(shí)驗(yàn)需要配備生物信息研發(fā)及管理人員，以保證分析流程、持續(xù)更新、性能確認(rèn)、維護(hù)及管理 ［12］；
（3）結(jié)果審核應(yīng)配備具有臨床感染病學(xué)相關(guān)知識的微生物檢驗(yàn)醫(yī)師。針對疑難報(bào)告，建議成立 mNGS 報(bào)告解讀團(tuán)隊(duì)，由具備臨床感染病學(xué)、臨床微生物檢驗(yàn)學(xué)、臨床分子生物學(xué)、生物信息學(xué)等相關(guān)專業(yè)知識的人員組成。所有人員均須通過崗位相關(guān)的培訓(xùn)和考核，并進(jìn)行定期能力評估方能上崗。
核酸提取和純化若使用手工操作，應(yīng)考慮不同標(biāo)本類型的差異、不同核酸提取試劑盒的提取效率、純度以及片段大小等因素；若使用自動(dòng)化核酸提取儀系統(tǒng)，需要綜合考慮檢測通量、自動(dòng)化程度、成本、核酸質(zhì)量等因素。
實(shí)驗(yàn)室應(yīng)確定原始測序數(shù)據(jù)及 FASTQ 文件在服務(wù)器上存儲(chǔ)的位置，并明確具備唯一標(biāo)識的統(tǒng)一命名，便于數(shù)據(jù)調(diào)用與快速分類查找。文件命名建議包含數(shù)據(jù)檢測/分析日期、檢測實(shí)驗(yàn)室名稱、標(biāo)本類型、測序批次、唯一的標(biāo)本編碼等。命名規(guī)則一旦確定不得隨意改動(dòng)。
實(shí)驗(yàn)室可通過 FASTQC［19］ 和 MultiQC［20］ 等軟件查看測序數(shù)據(jù)質(zhì)量、總數(shù)據(jù)量、堿基質(zhì)量值（Q20 和 Q30）等，結(jié)合測序芯片泳道上生成的簇密度設(shè)置質(zhì)控點(diǎn)（如簇密度是否偏離有效范圍，堿基識別質(zhì)量值≥Q30 的數(shù)據(jù)比例是否偏低）判斷本批次數(shù)據(jù)能否用于后續(xù)分析。數(shù)據(jù)過濾規(guī)則可根據(jù)實(shí)驗(yàn)室對 mNGS 檢測的敏感性和特異性需求進(jìn)行調(diào)整，建議設(shè)置 Q30 堿基數(shù)量占比>75%、有效序列長度不小于 50bp、含 N 堿基比例小于 10% 等參數(shù)閾值。
為了提高微生物數(shù)據(jù)的分析時(shí)效性，需要去除測序數(shù)據(jù)中的宿主序列，通常方法是把比對到人類基因組的序列進(jìn)行過濾。真菌和寄生蟲與人類的基因組序列有一定的同源性，在過濾宿主序列的過程中需要評估運(yùn)行時(shí)間、去除效率與非特異性去除（非人源序列而被錯(cuò)誤過濾）的序列比例。
物種注釋是病原宏基因組檢測最核心的內(nèi)容之一，主要是將通過質(zhì)量控制的非宿主序列與微生物參考數(shù)據(jù)庫比對，或者經(jīng)過從頭組裝成 contigs/scaffolds 后再比對到微生物參考數(shù)據(jù)庫，確定在特定序列相似性閾值（如≥97%）下的物種分類級別。物種注釋的準(zhǔn)確性取決于所選注釋工具的敏感性和特異性、算法閾值的合理性、參考數(shù)據(jù)庫的完整性及其納入微生物基因組的準(zhǔn)確性 ［12］。目前可用的注釋工具分為三類：
（1）DNA-to-DNA 比對工具；
（2）DNA-to-Protein 比對工具；
（3）基于特征標(biāo)記基因的比對工具。有研究表明，利用相同的模擬數(shù)據(jù)集測試不同的宏基因組學(xué)分類工具，發(fā)現(xiàn)不同的分類工具識別的物種數(shù)量可能相差 3 個(gè)數(shù)量級以上 ［21］。在 mNGS 中，DNA-to-DNA 工具往往比 DNA-to-Protein 工具能夠更好地進(jìn)行物種分類 ［22］，但 DNA-to-Protein 工具在識別新發(fā)和高度可變的基因序列時(shí)敏感性更高 ［23］。而在以注重物種豐度的微生物組學(xué)分析中，則推薦使用基于特征標(biāo)記基因的比對工具 ［24］。
總之，實(shí)驗(yàn)室在選擇物種注釋工具時(shí)，應(yīng)基于檢測的預(yù)期用途，從運(yùn)行速度、準(zhǔn)確率、精確率、召回率等維度評估性能 ［17］。實(shí)驗(yàn)室可使用近緣物種的基因序列對分析軟件的物種注釋功能進(jìn)行評估，另外在數(shù)據(jù)庫或分析算法有變更時(shí)，以及定期對本實(shí)驗(yàn)室的 mNGS 物種/基因注釋功能進(jìn)行評估。
微生物參考數(shù)據(jù)庫的選擇顯著影響物種注釋分類的結(jié)果 ［25,26］。《宏基因組測序病原微生物檢測生物信息學(xué)分析規(guī)范化管理專家共識》［17］ 中對 mNGS 常用微生物數(shù)據(jù)庫的特征有較為詳細(xì)的描述。目前沒有任何一個(gè)公共數(shù)據(jù)庫能夠包含所有的潛在人類病原體的基因組信息（假陰性風(fēng)險(xiǎn)），且數(shù)據(jù)庫中不可避免地存在一些注釋錯(cuò)誤或污染的序列（假陽性風(fēng)險(xiǎn)）［27］。因此在構(gòu)建、使用和管理這類數(shù)據(jù)庫時(shí)需要重點(diǎn)關(guān)注以下問題：
（1）充分評估數(shù)據(jù)庫的全面性以及納入物種在分類學(xué)上的代表性。同一微生物，往往具有遺傳差異的不同亞型或株，在選擇基因組時(shí)，應(yīng)該考慮到微生物的遺傳多樣性，盡可能多地納入不同亞型或株的高質(zhì)量基因組；
（2）無論所選參考基因組的來源如何，實(shí)驗(yàn)室都需要通過重測序或其他技術(shù)手段確認(rèn)其注釋的準(zhǔn)確性，序列的完整性，避免納入錯(cuò)誤注釋、命名錯(cuò)誤或代表性不足的微生物序列；
（3）病原體（尤其是 RNA 病毒）在自然狀態(tài)下是不斷發(fā)生變異的，所以需要及時(shí)（或定期）對參考數(shù)據(jù)庫中的基因組信息進(jìn)行更新及驗(yàn)證 ［28,29］，更新的頻率取決于實(shí)驗(yàn)室或臨床的需求，以及序列在公共數(shù)據(jù)庫中的上傳或更新時(shí)間 ［28］；發(fā)生可能影響結(jié)果的數(shù)據(jù)庫修改、替換及更新等活動(dòng)均需要重新進(jìn)行評估；建議實(shí)驗(yàn)室每年對微生物數(shù)據(jù)庫進(jìn)行審核，必要時(shí)隨時(shí)進(jìn)行更新。但是對于使用本地化服務(wù)器的實(shí)驗(yàn)室，構(gòu)建的數(shù)據(jù)庫大小需要權(quán)衡服務(wù)器的計(jì)算能力以及報(bào)告的時(shí)效性要求。
mNGS 檢測到的微生物常以讀長數(shù)作為結(jié)果，但它受測序量、標(biāo)本質(zhì)量等因素的影響，并且同張芯片不同文庫分配的下機(jī)數(shù)據(jù)量會(huì)有波動(dòng)，所以有必要對讀長進(jìn)行歸一化處理 ［30］。建議將每百萬測序讀長中匹配到某一微生物基因組的特異讀長（reads per million，RPM）作為歸一化指標(biāo) ［30］。如果希望比較不同微生物在同一文庫中的讀長，則還需考慮微生物基因組大小不同帶來的差異（理論上，在相同條件下，基因組越長，測得的讀長越多），建議通過計(jì)算每百萬測序量下每一千個(gè)堿基的基因組長度的歸一化讀長來消除這種影響 ［28］。需要注意，由于 mNGS 檢測原理不同于 qPCR，RPM 不能作為微生物核酸的定量指標(biāo)。
由于缺乏標(biāo)準(zhǔn)的 mNGS 生物信息學(xué)分析方案，各實(shí)驗(yàn)室自建分析流程內(nèi)部使用的分析軟件與數(shù)據(jù)庫處在不斷更新、確認(rèn)及完善的動(dòng)態(tài)過程中。為了保證每批次臨床標(biāo)本結(jié)果的可溯源性及可重復(fù)性，實(shí)驗(yàn)室需要明確每一次測試所使用的軟件及數(shù)據(jù)庫的版本，建議在報(bào)告單中體現(xiàn)，至少應(yīng)包括分析日期、軟件名稱和版本號、對每個(gè)組成工具及算法的用戶自定義參數(shù)和系統(tǒng)默認(rèn)值等 ［28］，可使用版本管理工具如 Conda 完成 ［31］。此外，可使用流程管理工具如 Snakemake 和 Nextflow 等對整個(gè)工具集進(jìn)行版本控制。
（1）臨床標(biāo)本測序數(shù)據(jù)集：注釋充分、特征明確的臨床標(biāo)本測序數(shù)據(jù)（FASTQ 或其他格式）［32］；
（2）計(jì)算機(jī)模擬測序數(shù)據(jù)：利用序列模擬軟件模擬生成測序數(shù)據(jù)集 ［16,33］，要求既要具有與真實(shí)測序數(shù)據(jù)質(zhì)量相同/相似的技術(shù)參數(shù)（文庫片段長度分布、測序模式、測序錯(cuò)誤類型及頻率、測序質(zhì)量值、測序深度等）［16,34］，也要盡可能對臨床標(biāo)本的背景成分信息如宿主核酸、微生物和試劑背景核酸等進(jìn)行模擬；
（3）組合數(shù)據(jù)集：利用序列模擬軟件定量模擬一種或多種目標(biāo)病原體的測序數(shù)據(jù)，然后將模擬序列添加到目標(biāo)病原體陰性標(biāo)本的真實(shí)測序數(shù)據(jù)中，形成接近臨床標(biāo)本的模擬數(shù)據(jù)集 ［16］。
利用上述數(shù)據(jù)開展性能確認(rèn)，確定干實(shí)驗(yàn)流程的主要性能指標(biāo)，包括準(zhǔn)確率、精確率、召回率和 F1-Score（即精確度和召回率的調(diào)和平均值）等 ［28,35］。如果在比對過程中出現(xiàn)寄生蟲的假陽性結(jié)果（寄生蟲為真核生物，與宿主序列相似度較高，且部分寄生蟲基因組數(shù)據(jù)中存在人源序列的污染），需要考慮設(shè)置更高的陽性匯報(bào)閾值或者對相應(yīng)寄生蟲的基因組數(shù)據(jù)進(jìn)行清洗。常見的寄生蟲匯報(bào)閾值為與陰性對照相比 RPM 達(dá)到 10 倍以上，基因組數(shù)據(jù)清洗常采用把目標(biāo)寄生蟲基因組單獨(dú)與人基因組比對并去除高度同源的序列 ［36］。
表 1 模擬參考品示例
注：人源細(xì)胞濃度 1×10 5 cells/ml
- 批內(nèi)精密度：將上述參考品在同一時(shí)間內(nèi)用相同批次試劑完成 3 個(gè)全流程重復(fù)，分析批次內(nèi)結(jié)果重復(fù)性。
- 批間精密度：用不同批次的試劑分別將上述參考品在 3 個(gè)工作日內(nèi)完成各 3 個(gè)全流程重復(fù)，分析批次間重復(fù)性。
- 可接受標(biāo)準(zhǔn)：對陽性標(biāo)本，分析結(jié)果是指通過生信流程得到的檢出病原中包括該參考品中的病原體，則記為正確結(jié)果，否則為錯(cuò)誤結(jié)果。結(jié)果一致的實(shí)驗(yàn)數(shù)占全部實(shí)驗(yàn)數(shù)比例高于 95%，判斷為可接受。
- 樣本選擇：全流程檢測不少于 20 例標(biāo)本，包括 6 例陽性參考品（每例模擬混合參考品包含不少于 4 種微生物），14 例臨床標(biāo)本（不少于 10 例培養(yǎng)陽性）。分析檢測結(jié)果與已知參考品的內(nèi)含微生物以及臨床綜合判斷結(jié)果是否一致，對于結(jié)果不一致的使用 qPCR 或者送至另一穩(wěn)定運(yùn)行的 mNGS 實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行差異檢驗(yàn)。
- 可接受標(biāo)準(zhǔn)：20 例標(biāo)本中物種準(zhǔn)確性≥90%，則驗(yàn)證通過。對于臨床標(biāo)本，金標(biāo)準(zhǔn)方法和結(jié)合臨床信息綜合判定的病原體在 mNGS 檢測結(jié)果列表之中可判定為符合。
- 濃度選擇：使用陽性參考品梯度稀釋至擬定的檢出限濃度，可重復(fù)測定 5 次或在不同批內(nèi)對該濃度標(biāo)本進(jìn)行 20 次重復(fù)測定（如測定 5d，每天測定 4 份標(biāo)本）。可根據(jù)情況選用稀釋液或陰性標(biāo)本，該稀釋液不得含有被驗(yàn)證的目標(biāo)病原體。
- 判斷標(biāo)準(zhǔn)：如果是 5 次重復(fù)檢測，必須全部檢出靶核酸；如果是 20 次檢測，必須檢出至少 19 次（95% 檢出率）靶核酸。
- 實(shí)驗(yàn)過程：將投入 5~10 倍 LoD 病原體的臨床模擬標(biāo)本，在 4℃、-20℃冰箱分別保存 1、4、7d，在-80℃冰箱分別凍融 1 和 2 次，評估對檢測結(jié)果的影響。
- 可接受標(biāo)準(zhǔn)：所有重復(fù)均檢出目標(biāo)病原體。
臨床檢測性能評價(jià)主要采用觀察性研究。觀察性研究中通過評價(jià) mNGS 檢測結(jié)果與臨床其他參考方法結(jié)果的一致性，確認(rèn)敏感性和特異性。研究應(yīng)遵循《世界醫(yī)學(xué)大會(huì)赫爾辛基宣言》的倫理準(zhǔn)則和國家涉及人的生物醫(yī)學(xué)研究倫理的相關(guān)要求，應(yīng)當(dāng)經(jīng)倫理委員會(huì)審查并同意。標(biāo)本量與預(yù)期用途、評價(jià)指標(biāo)等多種因素相關(guān)。標(biāo)本量估算通常是基于統(tǒng)計(jì)學(xué)要求的最低標(biāo)本量估計(jì) ［41］。值得注意的是，在評價(jià)某些罕見的病原體，陽性病例的數(shù)量有限，可以引用文獻(xiàn)報(bào)道的臨床敏感性和特異性作為理論支撐 ［42］。實(shí)驗(yàn)室可采用 “代表性病原體” 進(jìn)行臨床診斷性能評價(jià) ［43,44,45］，比如根據(jù)臨床預(yù)期用途選擇不同類型的常見的病原體 ［43］，以期為同類病原體提供參考和借鑒。近年來已發(fā)表數(shù)篇基于腦脊液、呼吸道標(biāo)本、血漿等標(biāo)本類型的 mNGS 檢測流程和臨床性能確認(rèn)的研究可供實(shí)驗(yàn)方案參考 ［16,25,36,46,47］。
- 盡早使用：危急重癥感染或局部感染不及時(shí)處理則后果嚴(yán)重，恐危及生命時(shí)，應(yīng)在常規(guī)病原檢測基礎(chǔ)上，盡早使用 mNGS 檢測輔助明確病原體 ［43,59］；特殊病原體感染，存在群體性感染事件風(fēng)險(xiǎn)，應(yīng)在開展常規(guī)快速檢測的同時(shí)，盡早使用 mNGS 檢測輔助明確病原體。
- 在治療過程中使用：高度疑似感染性疾病，但傳統(tǒng)微生物檢測反復(fù)陰性且治療效果不佳時(shí)，考慮在完善常規(guī)病原學(xué)檢測的同時(shí)或在其基礎(chǔ)上開展 mNGS 檢測；傳統(tǒng)病原學(xué)檢測的結(jié)果不能解釋臨床表現(xiàn)的全貌或/和抗感染治療的反應(yīng)，懷疑同時(shí)存在其他病原感染時(shí)，考慮在進(jìn)一步完善更多病原學(xué)檢測的同時(shí)或在其基礎(chǔ)上開展 mNGS 檢測；特殊患者如免疫抑制、器官移植術(shù)后、反復(fù)住院、合并基礎(chǔ)疾病，疑似繼發(fā)感染、新發(fā)感染時(shí)，考慮常規(guī)病原學(xué)檢測的同時(shí)或在其基礎(chǔ)上開展 mNGS 檢測 ［60,61］。
- 擇期使用：表現(xiàn)為慢性或局部感染，或慢性疾病不除外感染，在嘗試常規(guī)病原學(xué)檢查未能明確致病源或/和規(guī)范性經(jīng)驗(yàn)抗感染治療無效時(shí)，建議在進(jìn)一步完善常規(guī)病原學(xué)檢測的基礎(chǔ)上，與患者充分溝通后擇期使用 mNGS 檢測輔助明確病原體 ［51］。
mNGS 檢測技術(shù)幾乎適用于所有類型的臨床標(biāo)本，標(biāo)本的選擇須結(jié)合患者情況、流行病學(xué)、病原體特性、受累器官及感染部位等狀況綜合考慮。懷疑高致病性、新發(fā)或突發(fā)傳染病原微生物時(shí)，標(biāo)本運(yùn)送須經(jīng)相關(guān)部門批準(zhǔn)，嚴(yán)格按照《人間傳染的病原微生物目錄》［63］ 的危害程度分類及國際民用航空組織《危險(xiǎn)品航空安全運(yùn)輸技術(shù)細(xì)則》［64］ 的分類包裝及轉(zhuǎn)運(yùn)要求運(yùn)輸標(biāo)本，如通過其他交通工具運(yùn)輸也應(yīng)參照以上述標(biāo)準(zhǔn) ［65］。臨床常見標(biāo)本的選擇見表 2。
表 2 mNGS 檢測的臨床標(biāo)本類型
從無菌部位采集標(biāo)本，應(yīng)嚴(yán)格執(zhí)行無菌操作，避免污染。從有菌部位采集標(biāo)本，應(yīng)采取相應(yīng)防污染措施，避免定植或污染菌對結(jié)果的干擾。標(biāo)本采集后應(yīng)使用無菌、無核酸污染、帶蓋的專用容器，采集后封口膜密封，識別碼標(biāo)記，及時(shí)（建議 2h 內(nèi)）送檢。臨床在送檢時(shí)盡可能提供詳細(xì)的臨床信息（如患者流行病學(xué)史、感染癥狀體征、疑似感染灶、疑似病原體、影像學(xué)/病理學(xué)證據(jù)等）供實(shí)驗(yàn)室人員綜合參考以便于測序數(shù)據(jù)的正確解讀。標(biāo)本運(yùn)輸過程中須防污染、防震蕩，使用冷鏈系統(tǒng)轉(zhuǎn)運(yùn)。
法定傳染病病原體：包括《傳染病防治法》規(guī)定的各類傳染病病原體。病原體種類應(yīng)根據(jù)國家相關(guān)法律法規(guī)的修正進(jìn)行及時(shí)調(diào)整。其他烈性傳染病病原體：建議參考《人間傳染的病原微生物目錄》中對高致病性病原體的相關(guān)定義。
建議根據(jù)國家規(guī)定和驗(yàn)證需求將標(biāo)本在有資質(zhì)的實(shí)驗(yàn)室內(nèi)進(jìn)行分離培養(yǎng)、特異基因片段檢測、特異性抗原抗體檢測等方法復(fù)核。如沒有剩余標(biāo)本，應(yīng)在做好生物安全防護(hù)的情況下進(jìn)行臨床重新采樣，應(yīng)用傳染病診斷標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定的實(shí)驗(yàn)室診斷技術(shù)進(jìn)行病原檢測，基于病原檢測結(jié)果，結(jié)合臨床癥狀、流行病學(xué)史，依據(jù)現(xiàn)行傳染病診斷標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行診斷。
如患者被診斷為傳染病的，按照《傳染病防治法》等法律法規(guī)規(guī)定的流程上報(bào)疾控部門，并且對患者、標(biāo)本等進(jìn)行規(guī)范的處置。應(yīng)按要求將剩余標(biāo)本或重新采集標(biāo)本送上級部門進(jìn)行確認(rèn)，并上報(bào)患者情況，同時(shí)做好必要的患者隔離措施和相關(guān)治療工作。
若檢出疑似新發(fā)病原體，應(yīng)立即組織專家開展研判，尤其當(dāng)疑似新病原體的序列與已知的烈性或者高傳染性病原體序列相似，或者短時(shí)間內(nèi)從≥2 例流行病學(xué)相關(guān)患者中檢出疑似新病原體時(shí)，應(yīng)立即上報(bào)有關(guān)部門。
檢出法定傳染病及烈性傳染病病原，尤其是當(dāng)檢出甲類傳染?。ㄊ笠?、霍亂）以及部分傳染性較強(qiáng)、危害較大的乙類傳染病（如傳染性非典型肺炎、脊髓灰質(zhì)炎、人類高致病性禽流感、炭疽等）病原體，應(yīng)立即對下機(jī)數(shù)據(jù)的質(zhì)量，特別是比對到烈性傳染病的特異性序列的準(zhǔn)確性、讀長數(shù)、基因組覆蓋度等數(shù)據(jù)進(jìn)行嚴(yán)格核實(shí)，確認(rèn)可排除背景核酸污染以及特異性序列比對無誤的前提下，同時(shí)啟動(dòng)標(biāo)本復(fù)核程序。當(dāng)從標(biāo)本中檢出明確可導(dǎo)致感染且能排除污染、定植微生物和背景核酸時(shí)，應(yīng)報(bào)告高度懷疑該病原菌為引起感染的病原菌。患者無菌部位標(biāo)本如血液和腦脊液標(biāo)本中檢出可疑病原菌，在無其他感染病原證據(jù)且能排除污染、定植微生物和背景核酸時(shí)，應(yīng)報(bào)告為可疑致病微生物。從開放性腔道如呼吸道或可能存在皮膚定植菌污染部位的標(biāo)本中檢出條件致病微生物時(shí)應(yīng)結(jié)合序列數(shù)、文庫濃度、患者臨床病史信息、感染相關(guān)指標(biāo)，會(huì)同多學(xué)科專家進(jìn)行討論明確是否為責(zé)任病原體。報(bào)告單中應(yīng)至少包含檢出的病原微生物種屬名稱、唯一比對的讀長數(shù)、相對豐度和室內(nèi)質(zhì)控?cái)?shù)據(jù)，以及對術(shù)語、技術(shù)參數(shù)和病原微生物的注釋。mNGS 報(bào)告中的病原體物種名稱應(yīng)標(biāo)注標(biāo)準(zhǔn)的中英文名稱，部分可參考的網(wǎng)站包括細(xì)菌網(wǎng)站 https：//lpsn.dsmz.de/和真菌網(wǎng)站 https：//www.mycobank.org 等。
通過耐藥/毒力基因預(yù)測病原菌對抗菌藥物的敏感性以及病原體的致病力，可為臨床的抗感染治療提供參考依據(jù)。但需要注意的是，不是所有的耐藥/毒力基因存在即表達(dá)，可能存在基因型和表型不一致的情況；部分導(dǎo)致耐藥/致病的機(jī)制尚無法通過檢測基因來明確；目前對于耐藥/毒力基因的物種歸屬分析技術(shù)尚未完善。因此，應(yīng)謹(jǐn)慎開展以耐藥/毒力基因來預(yù)測病原微生物耐藥性和致病力。對于實(shí)驗(yàn)室可開展常規(guī)藥敏試驗(yàn)檢測病原菌對抗菌藥物敏感性結(jié)果的藥物，不宜以耐藥基因結(jié)果進(jìn)行預(yù)測，應(yīng)以表型法藥敏試驗(yàn)結(jié)果為準(zhǔn)。
執(zhí)筆人：
楊啟文（中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)院檢驗(yàn)科）；馬筱玲（中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)附屬第一醫(yī)院檢驗(yàn)科）；張建中（中國疾病預(yù)防控制中心傳染病預(yù)防控制所）；李軼（河南省人民醫(yī)院檢驗(yàn)科）；吳文娟（上海市東方醫(yī)院檢驗(yàn)科）；楊繼勇（解放軍總醫(yī)院檢驗(yàn)科）；韓東升（浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院檢驗(yàn)科）；李家斌（安徽醫(yī)科大第一附屬醫(yī)院感染科）；羅燕萍（解放軍總醫(yī)院檢驗(yàn)科）；周華（浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院呼吸科）；谷麗（首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京朝陽醫(yī)院感染科）；張西京（空軍軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科）；李敏（上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院檢驗(yàn)科）；單斌（昆明醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院檢驗(yàn)科）；胡付品（復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院抗生素研究所）；劉正?。ㄖ袊t(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)院感染科）；周海?。ㄖ袊膊☆A(yù)防控制中心傳染病預(yù)防控制所）
主要審稿專家（按姓氏首字母順序排列）：
陳德昌（上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科）；馮四洲（中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院血液病醫(yī)院血液科）；顧兵（廣東省人民醫(yī)院檢驗(yàn)科）；胡繼紅（國家衛(wèi)生健康委員會(huì)臨床檢驗(yàn)中心）；劉曉琳（國家衛(wèi)生健康委員會(huì)合理用藥專家委員會(huì)）；孫自鏞（華中科技大學(xué)附屬同濟(jì)醫(yī)院檢驗(yàn)科）；施毅（南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬金陵醫(yī)院呼吸科）；王明貴（復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院抗生素研究所）；王佳偉（首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京同仁醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科）；徐英春（中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)院檢驗(yàn)科）；肖永紅（浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院感染科）；俞云松（浙江省人民醫(yī)院感染科）；張耀華（中國藥師協(xié)會(huì)）；鄭磊（南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院檢驗(yàn)科）；鄭波（北京大學(xué)第一醫(yī)院感染科）；卓超（廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院感染科）；周鐵麗（溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院檢驗(yàn)科）
參考文獻(xiàn)：略
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